kromatografi HPLC

BAB I

PENDAHULUAN

1. Latar Belakang

Kimia analitik adalah cabang ilmu kimia yang berfokus pada analisis material untuk

mengetahui komposisi, struktur, dan fungsi kimiawinya. Secara tradisional, kimia analitik

dibagi menjadi dua jenis, kualitatif dan kuantitatif. Analisis kualitatif bertujuan untuk

mengetahui keberadaan suatu unsur atau senyawa kimia, baik organik maupun anorganik,

sedangkan analisis kuantitatif bertujuan untuk mengetahui jumlah suatu unsur atau senyawa

dalam suatu cuplikan. Kimia analitik modern dikategorisasikan melalui dua pendekatan,

target dan metode. Berdasarkan targetnya, kimia analitik dapat dibagi menjadi kimia

bioanalitik, analisis material, analisis kimia, analisis lingkungan, dan forensik. Berdasarkan

metodenya, kimia analitik dapat dibagi menjadi spektroskopi, spektrometri massa,

kromatografi dan elektroforesis, kristalografi, mikroskopi, dan elektrokimia.

Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan campuran berdasarkan perbedaan kecepatan perambatan komponen dalam medium tertentu. Pada kromatografi, komponen –

komponennya akan dipisahkan antara dua buah fase yaitu fase diam dan fase gerak. Fase

diam akan menahan komponen campuran sedangkan fase gerak akan melarutkan zat

komponen campuran. Komponen yang mudah tertahan pada fase diam akan tertinggal.

Sedangkan komponen yang mudah larut dalam fase gerak akan bergerak lebih cepat.

Sekarang ini, kromatografi sangat diperlukan dalam memisahkan suatu campuran senyawa.

HPLC didefinisikan sebagai kromatografi cair yang dilakukan dengan memakai fase diam

yang terikat secara kimia pada penyangga halus yang distribusi ukuranya sempit ( kolom )

dan fase gerak yang dipaksa mengalir dengan laju alir yang terkendali dengan memakai

tekanan tinggi sehingga menghasilkan pemisahan dengan resolusi tinggi dan waktu yang

relative singkat. HPLC atau KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan  pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang, antara lain :

farmasi; lingkungan; bioteknologi; polimer; dan industri- industri makanan. Dalam makalah ini akan dijelaskan beberapa keterangan tentang penggunaan HPLC ( High Performance Liquid Chromatography), dalam bidang kefarmasian yaitu HPLC Method for the Analysis of

Paracetamol, Cafeine and Dipyrone (Metode HPLC Untuk Analisis Parasetamol, Kafein dan

Antalgin).

BAB II

PEMBAHASAN

Teknik HPLC merupakan satu teknik kromatografi cair – cair yang dapat digunakan baikuntuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis kuantitatif dengan teknik HPLC didasarkan kepada pengukuran luas atau area puncak analit dalam kromatogram, dibandingkan dengan luas atau area larutan standar. Kegunaan umum HPLC adalah untuk pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis ; analisis ketidakmurnian (impurities); analisis senyawa- senyawa mudah menguap (volatile); penentuan molekul- molekul netral, ionic, maupun zwitter ion; isolasi dan pemurnian senyawa; pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya hampir sama; pemisahan senyawa- senyawa dengan jumlah sekelumit (trace elements), dalam jumlah yang banyak, dan dalam skala proses industry.

1)      Komponen-Komponen Penting Dari HPLC

1.      Pompa (Pump)

Ada dua tipe pompa yang digunakan, yaitu pompa kinerja konstan (constant pressure) dan

pompa pemindahan konstan (constant displacement). Pemindahan konstan dapat dibagi

menjadi dua, yaitu: pompa reciprocating dan pompa syringe. Pompa reciprocating

menghasilkan suatu aliran yang berdenyut teratur (pulsating), oleh karena itu membutuhkan

peredam pulsa atau peredam elektronik untuk, menghasilkan garis dasar (base line) detektor

yang stabil, bila detektor sensitif terhadapan aliran. Keuntungan utamanya ialah ukuran

reservoir tidak terbatas. Pompa syringe memberikan aliran yang tidak berdenyut, tetapi

reservoirnya terbatas.

·         Syarat – syarat pompa yang ideal:

1)      Mampu membangkitkan tekanan tinggi

2)      Pulse free – out put

3)      Control laju alir yang akurat

4)      Tahan korosi

5)      Terbuat dari bahan yang tahan terhadap fasa gerak

6)      Bebas pulsa

7)      Perlu“de gasser”

8)      Dapat menyalurkan fasa gerak pada rentang kecepatan dan tekanan lebar

9)      Dapat digunakan untuk melakukan elusi gradien

10)  Bekerja pada tekanan sampai 6000 psi (400 atm)

2.      Detektor (Detector)

Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen sampel di dalam kolom (analisis kualitatif) dan menghitung kadamya (analisis kuantitatif). Detektor yang baik

memiliki sensitifitas yang tinggi, gangguan (noise) yang rendah, kisar respons linier yang

luas, dan memberi respons untuk semua tipe senyawa. Suatu kepekaan yang rendah terhadap

aliran dan fluktuasi temperatur sangat diinginkan, tetapi tidak selalu dapat diperoleh.

Jenis – jenis detector

· SpektrofotometerUV –Visible

· Indeks bias

· Spektrofluorimeter( zatberfluoresensi)

· Konduktivitaslistrik( zationik)

· Spektrometerinfra merah

· Spektrometermassa( LC –MS )

· SpektrometerNMR ( LC –NMR )

Detektor KCKT yang umum digunakan adalah detektor UV 254 nm. Variabel panjang

gelombang dapat digunakan untuk mendeteksi banyak senyawa dengan range yang lebih luas.

Detektor indeks refraksi juga digunakan secara luas, terutama pada kromatografi eksklusi,

tetapi umumnya kurang sensitif jika dibandingkan dengan detektor UV.

3.      Injektor (injector)

Injektor merupakan tempat untuk memasukkkan sempel ke kolom. Waktu yang dibutuhkan

oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor disebut sebagai waktu retensi.

Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai sampel

menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu. Senyawa-senyawa yang

berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda. Untuk beberapa senyawa, waktu retensi akan

sangat bervariasi dan bergantung pada:

·         tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari pelarut)

·         kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada ukuran

·         partikel)

·         komposisi yang tepat dari pelarut

·         temperatur pada kolom

4.      Elusi Gradien

Elusi Gradien didefinisikan sebagai penambahan kekuatan fasa gerak selama analisis

kromatografi berlangsung. Efek dari Elusi Gradien adalah mempersingkat waktu retensi dari

senyawa-senyawa yang tertahan kuat pada kolom. Dasar-dasar elusi gradien dijelaskan oleh

Snyder.

Elusi Gradien menawarkan beberapa keuntungan :

a.              Total waktu analisis dapat direduksi

b.              Resolusi persatuan waktu setiap senyawa dalam campuran bertambah

c.              Ketajaman Peak bertambah (menghilangkan tailing)

d.             Efek sensitivitas bertambah karena sedikit variasi pada peak

5.       Kolom (Column)

Berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom KCKT dapat digunakan kembali

(reusable) . Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan kolom yang sama sebelum dari jenis

sampel yang diinjeksi, kebersihan dari solven dan jenis solven yang digunakan.

Kolom diisi dengan partikel padatan yang berukuran kecil dilapisi secara kimia oleh suatu

cairan yang berfungsi sebagai fasa diam. Komponen-komponen sample dibawa oleh cairan

fasa gerak yang dialirkan dengan bantuan tekanan tinggi melewati kolom fasa diam.

Komponen-komponen dipisahkan berdasarkan partisi antara fasa diam dan fasa gerak yang

satu sama lain tidak bercampur.

Efisiensi kolom salah satunya sangat tegantung dari besarnya partikel fase stasioner. Oleh

karena itu bila ukuran fase stasioner lebih kecil, maka tinggi plat teoritik akan berkurang,

sehingga jumlah plat teoritik akan bertambah, yang meningkatkan efisiensi kolom. Dengan

kolom yang pendek dan efisiensi, pemisahan akan berjalan dengan cepat. Terdapat banyak

analisis yang dikerjakan pada suhu kamar, suhu kolom sering dapat diatur dengan konstan

dengan memakai cara pemanasan. Sering dibutuhkan suhu kolom yang lebih tinggi dari suhu

kamar untuk mengatasi masalah daya larut solute yang dianalisis dan viskositas fase gerak

yang agak tinggi.

6.     Pengolahan Data (Data Handling)

Hasil dari pemisahan kromatografi biasanya ditampilkan dalam bentuk kromatogram pada rekorder.waktu retensi dan volume retensi dapat diketahui atau dihitung. Ini bisa digunakanuntuk mengidentifikasi secara kualitatif suatu komponen, bila kondisi kerja dapat dikontrol. Lebar puncak dan tinggi puncak sebanding atau proporsional dengan konsentrasi dan dapat digunakan untuk memperoleh hasil secara kuantitatif.

2)      PRINSIP KERJA HPLC

Prinsip dasar HPLC (High Performance Liquid Chromatografi) adalah pemisahan senyawa-senyawa berdasarkan kepolaran, dimana terdapat fase mobile (gerak) dan fase stasioner (diam). Fase mobilenya adalah sampel dan eluen yang bercampur, dan fase stasionernya adalah silika gel yang mengandung hidrokarbon. Sehingga senyawa yang memiliki kepolaran yang lebih tinggi akan tertahan pada fase stasioner yang bersifat polar.

Metode pemisahan umum dalam HPLC tergantung sifat polaritas senyawa dalam eluat;

·         Fasa Normal

•Fasa gerak nonpolar

•Fasa diam polar

·         Fasa Terbalik

•Fasa gerak polar

•Fasa diam nonpolar

Resolusi adalah pengukuran secara fisik suatu pemisahan. Resolusi dapat ditingkatkan

dengan mengoptimasi parameter-parameter HPLC yaitu retensi,selektifitas, dan efisiensi.

Secara praktis parameter-parameter HPLC tersebt dapat dioptimalkan dengan mengubah:

1.      Komposisi dari fase gerak

2.      Laju alir

3.      Sifat kimia dari fase gerak

4.      Jenis kolom

Metode HPLC dapat digunakan untuk analisa kuantitatif dan sekaligus kualitatif. Untuk

analisa kualitatif dengan membandingkan kromatogram sampel dengan kromatogram baku

pembanding berdasarkan waktu retensinya.

Sedangkan untuk analisa kuatitatif dapat digunakan dengan persamaan : Cx = Ax / Ap X Cp

Keterangan :

A = Peak area = Luas puncak

C = Konsentrasi

X = sampel

P = pembanding Atau jika ingin mendapatkan data yang lebih valid dapat pula ditentukan dengan menggunakan kurva kalibrasi larutan standar.

HPLC yaitu alat yang berfungsi mendorong analit melalui sebuah kolom dari fase diam ( yaitu sebuah tube dengan partikel bulat kecil dengan permukaan kimia tertentu) dengan memompa cairan (fase bergerak) pada tekanan tinggi melalui kolom. Sampel yang akan dianalisis dijadikan dalam volume yang kecil dari fase bergerak dan diubah melalui reaksi kimia oleh fase diam ketika sampel melalui sepanjang kolom.

Tujuan penggunaan alat ini adalah mengetahui kadar asam organik. Waktu saat analit keluar dari ujung kolom disebut waktu retensi dan merupakan suatu

karakteristik yang unik dari tiap analit. Penggunaan dari tekanan menaikkan kecepatan linear

memberikan lebih sedikit waktu bagi analit untuk berdifusi, dan menghasilkan

chromatogram. Pelarut yang banyak digunakan yaitu air dan zat-zat organik seperti metanol.

HPLC ini digunakan untuk asam organik, seperti asam formiat dan asam asetat. Jika sampel

mula-mula berbentuk padatan harus di-distruksi dulu kemudian di-treatment sehingga berupa

larutan homogen yang tidak terdapat endapan lagi dan bening karena syarat sampel yang

dapat dianalisa menggunakan HPLC adalah harus tidak ada endapan dan harus bening.

3)    Penerapan HPLC Dalam Analisis Senyawa (Obat) Dalam Campuran

HPLC sering digunakan antara lain untuk menetapkan kadar senyawa aktif pada obat, produk hasil samping proses sintesis, atau produk- produk degradasi dalam sediaan farmasi.

Keterbatasan metode HPLC ini adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali jika HPLC

dihubungkan dengan spektometer massa (MS). Keterbatasan lainnya adalah sampel sangat

kompleks maka resolusi yang baik sulit diperoleh.

1.             Parasetamol

·         Rumus struktur :

·         Nama Kimia : 4- Hidroksiasetanilida

·         Rumus Molekul : C8H9NO2

·         Berat Molekul : 151,16

·         Pemerian : serbuk, putih, tidak berbau, rasa sedikit pahit.

·         Kelarutan : larut dalam air mendidih dan dalam natrium hidroksida 1 N, mudah larut dalam etanol. (Depkes RI, 1995).

Parasetamol atau N-asetil-p-aminofenol atau asetaminofen merupakan derivat para-amino

fenol yang berkhasiat sebagai analgesik-antipiretik. Asetaminofen merupakan pengganti yang

baik untuk analgesik dan antipiretik aspirin pada penderita dengan keluhan saluran cerna dan

pada mereka dengan perpanjangan waktu perdarahan yang tidak menguntungkan.

Asetaminofen merupakan analgetik dan antipiretis.

Parasetamol adalah senyawa yang memiliki sifat polar dan gugus kromofor yang dimilikinya

menyebabkan senyawa ini dapat menyerap sinar UV. Karakteristik senyawa ini

memungkinkan analisis dengan teknik HPLC menggunakan kolom nonpolar seperti C-18 dan

fasa gerak polar seperti methanol/ air. Parasetamol diabsorbsi cepat dan sempurna melalui

saluran cerna. Konsentrasi tertinggi plasma dicapai dalam waktu ½ jam dan masa paruh

plasma antara 1-3 jam. Obat ini tersebar ke seluruh tubuh. Dalam plasma, 25% parasetamol

terikat protein plasma. Parasetamol digunakan sebagai analgesic dan antipiretik.

Pengujian kadar parasetamol dalam obat menggunakan teknik HPLC , dalam proses

analisisnya HPLC memiliki beberapa tahapan. Diawali dengan menginjeksikan sampel uji

yaitu larutan obat yang sebelumnya telah disaring dengan membran PTFE ke dalam kolom

HPLC dengan injektor khusus / syringe yang bervolume 20 µL, penyaringan sebelum

penginjeksian ini dilakukan agar tidak terjadi penyumbatan didalam kolom dan

menghilangkan gas dari pelarutnya. Sampel didorong cepat saat melalui kolom dengan

bantuan pompa bertekanan tinggi. Di dalam kolom, komponen- komponen pada sampel

dipisahkan berdasarkan pada perbedaan kekuatan interaksi solut terhadap fasa diamnya. Solut

yang interaksinya kurang kuat akan keluar lebih lambat dari kolom daripada solut lainnya.

Komponen akan keluar dari kolom dengan kecepatan yang berbeda dan terdeteksi oleh

detektor. Detektor yang digunakan adalah detektor UV karena parasetamol merupakan

senyawa organik yang dapat menyerap sinar UV. Pengujian ini menggunakan panjang

gelombang 243 nm dengan mempertimbangkan panjang gelombang methanol yaitu 205 nm

dan air yaitu 190 nm. Teknik yang dilakukan kali ini merupakan “reverse phase” atau fasa

terbalik karena teknik ini menggunakan pelarut polar sebagai fasa gerak sedangkan fasa

diamnya menggunakan pelarut non- polar. Penggunaan fasa gerak dan fasa diam yang

berbeda kepolarannya ini bertujuan agar sampel uji tidak bereaksi dengan fasa diamnya saat

melewati kolom HPLC. Sampel melewati kolom HPLC tentunya memiliki jangka waktu

yang terukur dan juga menjadi parameter, waktu yang dibutuhkan sampel untuk melewati

kolom ini disebut waktu retensi. Dalam pengujian parasetamol dalam obat, waktu retensi

yang terukur adalah antara 2,19 hingga 2,2. Selanjutnya hasil analisis dengan HPLC ini

menghasilkan suatu citra berupa kromatogram. Kromatogram ini merupakan grafik antara

intensitas komponen yang dibawa oleh fasa gerak terhadap waktu retensi. Seharusnya

tampilan kromatogram ini berupa grafik lurus, lancip, dan simetris. Tetapi data yang

diperoleh pada percobaan ini sedikit melebar dan tidak simetris tentunya. Ini disebabkan

antara lain oleh adanya difusi didalam kolom HPLC, difusi yang terjadi adalah difusi

longitudinal dan difusi transfer massa. Difusi longitudinal itu sendiri disebabkan oleh

penyebaran komponen yang tidak sama sedangkan difusi transfer massa disebabkan oleh

kecepatan komponen yang tidak merata. Terdapat beberapa parameter pemisahan dalam

HPLC, yaitu laju alir eluen yaitu sebesar 0,5 mL/ menit, ketebalan stasioner kolom C-18 yaitu 15 cm, ukuran partikel analit, dan laju difusi yang sudah disebutkan diatas. Parameter-

parameter ini dapat menyebabkan kejanggalan dalam pencitraan kromatogram seperti

pelebaran pada puncak. Adanya pelebaran puncak pada kromatogram mengindikasikan

terjadinya overlapping analit yang belum terpisahkan dalam kolom. Semakin tinggi laju

difusinya maka komponen dalam sampel akan semakin sulit dipisahkan secara efisien. Dari

grafik luas area terhadap konsentrasi (ppm) dapat dihitung kadar parasetamol dalam sampel

obat. Data yang diperoleh menunjukkan bahwa dari sampel obat sebanyak 12,5 mg diperoleh

kadar parasetamol sebesar 83,444 % sedangkan dari massa rata-rata tablet obat sebesar 738,2

mg diperoleh massa parasetamol pada tiap tablet obat sebesar 615,9836 mg. Dapat

disimpulkan bahwa kadar parasetamol dalam tablet obat adalah sebesar 615,98 mg per

tabletnya.

2.      Kafein

 Rumus struktur :

· Nama Kimia : 1,3,7-Trimetil xantin

· Rumus Molekul : C8H10N4O2

· Berat Molekul : 194,19

· Pemerian : serbuk putih atau bentuk jarum mengkilat putih,biasanya menggumpal, tidak berbau, rasa pahit.

· Kelarutan : Agak sukar larut dalam air, dalam etanol, mudah larut dalam kloroform, sukar larut dalam eter. (Depkes RI, 1995).

Kofein berkhasiat menstimulasi SSP, dengan efek menghilangkan rasa letih, lapar dan

mengantuk, juga daya konsentrasi dan kecepatan reaksi dipertinggi, prestasi otak dan suasana

jiwa diperbaiki. Kofein juga memperkuat kontraksi jantung, vasodilatasi perifer dan diuretis.

Kofein digunakan sebagai penyegar. Zat ini sering dikombinasikan dengan Parasetamol atau

asetosal untuk memperkuat efek analgetisnya.

Kafein dosis sedang menyebabkan insomnia, ansietas dan agitasi. Dosis tinggi diperlukan

untuk memperlihatkan toksisitas berupa muntah dan konvulsi. Dosis letal sekitar 10 g (kira-

kira 100 cangkir kopi) yang menimbulkan aritmia jantung. Kematian karena kafein sangat

tidak mungkin. Letargi, iritabel dan sakit kepala terjadi pada pengguna yang secara rutin

minumg lebih dari 600 mg kopi per hari ( sekitar 6 cangkir kopi per hari) dan mendadak

berhenti. (Mycek, 2001).

ANALISIS KUANTITATIF

Metoda Persentase Tinggi / Lebar Puncak Metoda ini disebut juga Metoda Normalisasi Internal. Untuk analisis kuantitatif diasumsikan bahwa lebar atau tinggi Puncak (Peak) sebanding (proportional) dengan kadar / konsentrasi zat yang menghasil puncak. Dalam metoda yang paling sederhana diukur lebar atau tinggi Puncak, yang kemudian dinormalisasi (ini berarti bahwa setiap lebar atau tinggi Puncak diekspresikan sebagai suatu persentase dari total). Hasil normalisasi dari lebar atau tinggi puncak memberikan komposisi dari campuran yang dianalisis. Kita harus mengasumsi bahwa kita memperoleh respons detektor yang sama untuk setiap komponen Untuk mengatasi kesulitan ini, maka kalibrasi detektor diperlukan. Kafein berkhasiat menstimulasi SSP, dengan efek menghilangkan rasa letih, lapar dan mengantuk, juga daya konsentrasi dan kecepatan reaksi dipertinggi, prestasi otak dan suasana jiwa diperbaiki. Kofein juga memperkuat kontraksi jantung, vasodilatasi perifer dan diuretis. Kofein digunakan sebagai penyegar. Zat ini sering dikombinasikan dengan Parasetamol atau asetosal untuk memperkuat efek analgetisnya. Kafein dosis sedang menyebabkan insomnia, ansietas dan agitasi. Dosis tinggi diperlukan untuk memperlihatkan toksisitas berupa muntah dan konvulsi. Dosis letal sekitar 10 g (kira-kira 100 cangkir kopi) yang menimbulkan aritmia jantung. Kematian karena kafein sangat tidak mungkin. Letargi, iritabel dan sakit kepala terjadi pada pengguna yang secara rutin minum lebih dari 600 mg kopi per hari ( sekitar 6 cangkir kopi per hari) dan mendadak berhenti. (Mycek, 2001).

4)    Kelebihan Dan Kekurangan Metode Analisis Dengan HPLC

4. 1. Kelebihan

·    Kerja lebih mudah dengan automatisasi dalam prosedur analisis dan pengolahan data

·    Volume sampel kecil

·    Daya pisah tinggi

·    Merupakan metode analitis:

o   Cepat

o   Peka

o   Akurat

o   Tepat

o   Reproducible

o   JugaPreparatif

·    Dapat digunakan untuk analisis sampel organic dan anorganik, bersifat volatile dan non volatil, stabil dan tidak stabil secara thermal.

·    Pilihan fasa diam dan fasa geraknya luas

4. 2. Kekurangan

·      Larutan harus dicari fase diamnya terlebih dahulu

·      Hanya bisa digunakan untuk asam organic

·      Harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan gradient

elusi

·      Harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang terbatas

BAB III

PENUTUP

 Kesimpulan

1. Komponen utama dari HPLC yaitu, pompa, injector, elusi gradient, kolom, detector,

pengolahan data.

2.      Prinsip dasar HPLC (High Performance Liquid Chromatografi) adalah pemisahan

senyawa-senyawa berdasarkan kepolaran, dimana terdapat fase mobile (gerak) dan

fase stasioner (diam). Fase mobilenya adalah sampel dan eluen yang bercampur, dan

fase stasionernya adalah silika gel yang mengandung hidrokarbon. Sehingga senyawa

yang memiliki kepolaran yang lebih tinggi akan tertahan pada fase stasioner yang

bersifat polar.

3.      HPLC sering digunakan antara lain untuk menetapkan kadar senyawa aktif pada obat,

produk hasil samping proses sintesis, atau produk- produk degradasi dalam sediaan

farmasi. Contohnya adalah menganalisis parasetamol dan kafein dalam suatu

campuran.

4.      HPLC sebagai suatu metode pemisahan memiliki beberapa keuntungan yaitu

menghasilkan pemisahan yang sangat cepat, dapat memisahkan zat-zat yang tidak

mudah menguap ataupun tak tahan panas, banyak pilihan fasa geraknya, mudah untuk

mendapatkan kembali cuplikan, karena detector pada KCKT tidak merusak komponen

zat yang dianalisis, dan dapat dirangkai dengan instrumen lain untuk meningkatkan

efisiensi pemisahan. Sedangkan kekurangannya adalah larutan harus dicari fase

diamnya terlebih dahulu, hanya bisa digunakan untuk asam organic, harus mengetahui

kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan gradient elusi, harganya mahal

sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang terbatas.